在成功守护纽约后，四只忍者龟和他们的伙伴爱普莉尔、凯西·琼斯享受着英雄的生活。直到一个神秘的组织“原初之眼”找上门，为首的是四只看似更强大、更冷酷的“忍者龟”。他们自称是“原版”，而李奥纳多、米开朗基罗等人只是某次基因实验失败的复制品，本不该拥有自我意识。原版们要回收所有“错误代码”，即消灭他们。莱昂纳多带领兄弟们逃亡，开始质疑自己的存在意义。他们必须找到当初创造他们的科学家留下的最后一段基因序列，证明“复制品”也可以拥有灵魂和独一无二的价值。一场关于身份认同与兄弟羁绊的终极暗影之战拉开帷幕。
这个系列前所未有的黑暗哲学转向。动作戏依旧爽快，但核心冲突变成了“何以为真”。反派原版龟的设计非常惊艳，那种阴冷与主角们的热血形成鲜明对比。最后米开朗基罗关于“披萨边角料也能吃”的即兴演讲，是全片最高光时刻。
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